Q：液相、液质检测中，外标法、内标法、加标回收、样品加标有什么区别？

A：液相液质检测中，与待测组分相同的标准物质（标准品，标品），习惯称为外标；与待测组分类似的标准物质如同位素标记内标物质（D、¹³C、¹⁵N等）或类似物质，习惯称为内标。以上4种方法会用到外标和内标，根据方法和目的等区别汇总如表所示。

如下图流程所展示：

1.标准溶液：4种方法均需配置添加外标的标准溶液，内标法是唯一在外标的标准溶液中添加相同浓度内标的方法。

2.加标回收：加标回收和内标法都需要在样品提取前加入标准品，但加入的标准品不同，分别是外标和内标，且最终计算方法不同。加标回收主要目的是计算回收率，反应提取效率，需要设置对照组（未加标样品），计算公式为：回收率 = 100%◊（加标样品待测组分浓度-未加标样品待测组分浓度）÷ 已知加入标准品的理论浓度。该理论浓度计算公式为：已知加入标品理论浓度 = 加入标准品的体积 ◊加入标准品的浓度 ÷ 提取液最终体积。

3.内标法：内标法的主要目的是抵消误差，提高数据准确性，样品和标准品溶液中均含有相同浓度的内标物质。测试数据中，既可以反映每个样品的回收率（回收率 =  100% ◊ 样品中内标物质峰面积 ÷ 标准溶液中内标物质峰面积）和基质效应（峰偏离矫正），也可以通过绘制浓度比（X）-峰面积比（Y）标准曲线来计算样品中待测物质的浓度。该曲线包含标准溶液内标、外标峰面积，样品内标、外标浓度4个参数，以比值做图，通过样品内标与标准溶液内标的比值矫正误差，进行了归一化处理。加标回收可用于液质或液相预实验中前处理的方法比较，而内标法更多地应用于液质定量检测。

4.样品加标：样品加标是在样品提取完成的待测液中加外标，常用来判断基质效应。外标法是唯一不在样品里加外标的方法，也是液质、液相最常用的定量方法。因此采用该方法时，建议预实验完成加标回收实验，优化提取方法，使回收率尽量达到90%以上。如果出现样品和标准溶液出峰偏差，可考虑采用基质标或样品加标的方法改善或验证。

同时特别注意：

1、标准品的质量：标准品作为定量检测的参照物，对样品定量准确性起关键作用。建议选择标准品纯度为色谱纯98%及以上，并且选购品质有保障的公司和品牌。CAS号是标准品的身份代码，建议记录保存，方便实验沟通和复查。标准品到货后，建议根据保存条件和标准品溶解性质，选择溶解分装或粉末等合适的方式低温避光保存，记录存放时间，注明保质期限。有些物质低温保存可能发生不可逆析出，注意保存温度的选择。液体样品建议小剂量分装保存，1次用1份（管），减少反复冻融和打开带来的降解、异构等变化。

2、标准溶液的配制：根据标准品的包装量选择合适体积、种类的溶剂溶解。如为粉末，选用百万分之一天平，称量1mg左右标准品，加入对应数字体积溶剂（实际称重0.9873 mg，加入0.9873 mL溶剂），即得到1 mg/mL的标准储备液，有效期与标准品性质及储存条件有关，具体可参考标准、文献等资料。标准储备液在检测前按照一定倍数逐级稀释为梯度标准溶液，现用现配。为使标准溶液溶解充分、降低移液枪误差、提高线性系数，尽量选择较大体积（50 uL、100 uL、200 uL等）配置（如图所示供参考）。为保证进样针正常吸取到标品溶液，进样瓶内的液面高度须高于0.5 mL刻度线（如图所示）。标准溶液范围根据样品浓度范围选择，尽量横跨3~4个数量级。如果样品超出线性范围，可将样品稀释到线性范围内。

3.混合标准溶液的配制：以1mL 体系为例，如稀释10倍，则各吸取储备液100 uL，溶剂补足到1mL，那么每一个标准物质浓度都被稀释到储备液的10%，得到的混标溶液过0.22 um滤膜后，继续根据需要进行梯度稀释。如果标准品种类超过20个，可把体系放大到2 mL及以上，同时调整每个标准品的加入量，方便整除。

4.溶剂标和基质标：溶剂标，用常见的化学试剂溶解标准品，如甲醇、乙腈、水等；基质标，用阴性对照样品的基质溶液溶解标准品，如有些蔬菜选用黄瓜基质。基质效应因样品复杂程度、净化程度和标准物质性质等原因，常表现为信号抑制或增强作用。基质标可以抵消基质效应的影响，使检测结果更准确。但是有些样品很难找到阴性对照样品制备基质液，可考虑稀释样品降低基质溶液浓度或净化样品减少基质效应的影响，但可能因此造成待测物质浓度过低而不宜被检测。

资料整理：王 宁

编辑发布：王 宁